近日，植物保護學(xué)院李向東教授團隊在《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了題為“RabE1a-and SEC10b-mediated exocytosis and AP2-mediated endocytosis are involved in the intracellular transport of tobamoviruses”的研究論文。該研究揭示了番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV）等煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）在寄主細胞內(nèi)的移動的分子機制，并鑒定到抗病毒新靶標(biāo)。

ToBRFV對全球番茄、辣椒等茄科作物構(gòu)成嚴重威脅。ToBRFV自2014年首次發(fā)現(xiàn)以來，已在全球范圍內(nèi)暴發(fā)流行。目前，廣泛用于防控?zé)煵莼ㄈ~病毒屬病毒中煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）的番茄抗性基因Tm-22，對ToBRFV沒有抗性，亟需尋找新的分子靶標(biāo)。李向東教授團隊發(fā)現(xiàn)ToBRFV的移動蛋白（movement protein，MP）首先通過RabE1a和SEC10b介導(dǎo)的分泌途徑移動到質(zhì)膜，隨后依賴AP2β介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移動到胞間連絲，實現(xiàn)細胞間移動。敲除或沉默RabE1a、SEC10b、AP2β等基因，均可顯著抑制ToBRFV及TMV、ToMV、ToMMV等煙草花葉病毒屬病毒的侵染。研究結(jié)果為抗ToBRFV等煙草花葉病毒屬病毒的育種提供理論基礎(chǔ)。全文主要研究結(jié)果如下：

1.RabE1a參與ToBRFV在植物中的細胞間移動

為了明確RabE1a在ToBRFV侵染中的作用，研究者使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在番茄栽培種Ailsa Craig中敲除了SlRabE1a。在接種后8天后，與野生型番茄植株相比，Slrabe1a敲除植株的系統(tǒng)葉表現(xiàn)出較輕的癥狀（圖1A）。Western blotting結(jié)果顯示，Slrabe1a敲除株系番茄植株中的ToBRFV衣殼蛋白積累水平顯著低于對照植株（圖1B）。這些結(jié)果表明，SlRabE1a參與ToBRFV的系統(tǒng)侵染。研究者構(gòu)建了NbRabE1a.1敲降的轉(zhuǎn)基因本氏煙系NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#。RT-qPCR結(jié)果顯示，NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#植株中NbRabE1a.1的沉默效率分別達到66%和92%（圖1C）。隨后，研究者接種了侵染性克隆pCBToBRFV-GFP。在接種后6天，接種了ToBRFV-GFP的野生型本氏煙植株的系統(tǒng)葉呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，但在NbRabE1a.1-KD2#或NbRabE1a.1-KD4#植株中分別觀察到微弱熒光或無熒光（圖1D）。在野生型本氏煙植株中檢測到ToBRFV CP的積累，但在NbRabE1a.1-KD2#或NbRabE1a.1-KD4#植株中檢測到的CP積累量很少或沒有（圖1E）。

為進一步研究RabE1a在ToBRFV細胞間運動中的作用，研究者將攜帶ToBRFV-GFP侵染性克隆的農(nóng)桿菌OD600值調(diào)整至0.0001，并將其農(nóng)桿菌浸潤到野生型和NbRabE1a.1-KD本氏煙葉片中。在接種后84小時，NbRabE1a.1-KD2#和NbRabE1a.1-KD4#植株浸潤葉片中ToBRFV-GFP侵染點的熒光直徑顯著小于野生型本氏煙植株葉片中的熒光直徑（圖1F和1G）。這些結(jié)果表明RabE1a在ToBRFV細胞間運動中起關(guān)鍵作用。

為了確定沉默RabE1a.1是否影響ToBRFV MP的PD定位，研究者在野生型和NbRabE1a.1-KD本氏煙植株的葉片中瞬時表達ToBRFV MP-GFP。在農(nóng)桿菌浸潤后48小時，通過共聚焦顯微鏡觀察浸潤區(qū)域。結(jié)果顯示，NbRabE1a.1-KD葉片中MP-GFP的熒光強度低于野生型本氏煙葉片（圖1H和1I）。Western blotting結(jié)果顯示，野生型本氏煙和NbRabE1a.1-KD葉片中MP-GFP的表達水平?jīng)]有顯著差異（圖1J）。這些結(jié)果表明，RabE1a調(diào)控MP向PD的轉(zhuǎn)運，從而影響ToBRFV的細胞間運動。

圖1. RabE1a在ToBRFV系統(tǒng)侵染和細胞間運動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.RabE1a與SEC10b相互作用，共同調(diào)控MP向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運以及ToBRFV的細胞間運動

為研究SlRabE1a調(diào)控MP向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運的機制，研究者分析了SlSEC10b與SlRabE1a之間的相互作用。Co-IP結(jié)果顯示，SlRabE1a可以與SlSEC10b相互作用(圖2A)。BiFC實驗進一步證實了它們的相互作用(圖2B)。

為檢驗SEC10b是否對病毒侵染至關(guān)重要，研究者通過TRV載體在番茄植株中沉默了SlSEC10b。沉默12天后，對SlSEC10b沉默的番茄植株接種ToBRFV。接種后8天，接種TRV-GUS對照的番茄植株系統(tǒng)葉中的花葉癥狀比接種TRV-SlSEC10b的植株更嚴重(圖2C)。RT-qPCR結(jié)果顯示，SlSEC10b沉默的番茄植株中SlSEC10b mRNA 的水平約為對照植株的40%(圖2D)。Western blotting 顯示，SlSEC10b沉默的番茄植株中CP積累水平約為對照植株的49%(圖2E)。共聚焦顯微鏡分析結(jié)果顯示，NbSEC10b沉默植株浸潤葉片中的ToBRFV-GFP侵染點顯著小于對照植株(圖2F和2G)，表明在本氏煙葉片中沉默NbSEC10b減少了ToBRFV的細胞間運動。先前的研究表明，小分子化合物endosidin2(ES2)特異性靶向分泌囊泡復(fù)合體的一個保守亞基EXO70，并破壞其在介導(dǎo)分泌囊泡錨定及質(zhì)膜融合過程中的關(guān)鍵功能，最終導(dǎo)致分泌途徑受到抑制。為進一步研究分泌途徑在介導(dǎo)ToBRFV細胞間運動中的作用，在本氏煙植株接種ToBRFV-GFP后48小時用ES2進行處理。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，處理后48小時，與對照組相比，ES2處理顯著抑制了ToBRFV的細胞間運動(圖2H和2I)。

為確定沉默SEC10b是否影響ToBRFV MP的胞間連絲定位，研究者在NbSEC10b沉默和非沉默植株的葉片中瞬時表達了ToBRFV MP-GFP。農(nóng)桿菌浸潤后48小時，通過共聚焦顯微鏡觀察浸潤區(qū)域。結(jié)果顯示，NbSEC10b沉默葉片中MP-GFP的熒光強度低于非沉默葉片(圖2J和2K)。Western blottin結(jié)果顯示，NbSEC10b沉默和非沉默葉片中MP-GFP的表達水平?jīng)]有顯著差異(圖2L)。

隨后，研究者檢測了NbSEC10b沉默和非沉默植株葉片質(zhì)膜中MP的積累情況。結(jié)果顯示，沉默NbSEC10b顯著降低了MP在質(zhì)膜中的積累(圖2M)。這些結(jié)果表明，RabE1a與SEC10b相互作用，共同調(diào)控MP向質(zhì)膜和胞間連絲的轉(zhuǎn)運，從而促進ToBRFV的細胞間運動。

圖2. RabE1a與SEC10b相互作用共同調(diào)控MP向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運和ToBRFV細胞間移動。

3.銜接蛋白AP2β與MP相互作用，調(diào)控MP從質(zhì)膜到胞間連絲的運輸以及ToBRFV細胞間移動

研究者進一步分析了內(nèi)吞途徑是否參與ToBRFV的細胞間運動。由于AP2復(fù)合體通過識別貨物蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，研究者進一步探討了AP2復(fù)合體是否識別MP。BiFC實驗表明ToBRFV MP 與SlAP2β相互作用（圖3A）。Co-IP結(jié)果進一步證實了MP與SlAP2β之間的相互作用（圖3B）。

為測試SlAP2β在ToBRFV侵染中的作用，研究者通過TRV載體在番茄植株中沉默了SlAP2β（圖3C）。隨后，研究者將ToBRFV接種到SlAP2β沉默和非沉默的番茄植株中。在接種后8天，接種TRV-SlAP2β的植株系統(tǒng)葉表現(xiàn)出的癥狀比接種TRV-GUS對照的植株輕（圖3D）。Western blotting結(jié)果顯示，沉默SlAP2β降低了ToBRFV的積累水平（圖3E）。研究者進一步構(gòu)建了NbAP2β-KD轉(zhuǎn)基因本氏煙系NbAP2β-KD7#和NbAP2β-KD8#。共聚焦顯微鏡分析顯示，NbAP2β-KD植株浸潤葉片中的ToBRFV-GFP侵染點小于對照植株（圖3F和3G）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)NbAP2β的敲低顯著降低了胞間連絲和質(zhì)膜處GFP的相對熒光強度（圖3H和3I）。盡管ToBRFV MP在胞間連絲的定位減少，但其在NbAP2β敲低葉片中的總積累水平顯著高于對照植株（圖3J）。這些結(jié)果表明AP2β參與MP轉(zhuǎn)運到胞間連絲。

研究者進一步檢測了野生型和NbAP2β-KD本氏煙葉片中質(zhì)膜富集MP的積累情況。結(jié)果顯示，敲低AP2β增加了MP在質(zhì)膜的積累（圖3K）。這些發(fā)現(xiàn)表明AP2β調(diào)控MP從質(zhì)膜到胞間連絲的轉(zhuǎn)運，從而促進ToBRFV的細胞間運動。

圖3. AP2β與MP相互作用，參與MP從質(zhì)膜轉(zhuǎn)運至胞間連絲以及ToBRFV的細胞間運動

4.RabE1a與煙草花葉病毒屬病毒的MP互作并調(diào)控病毒的細胞間運動。

為研究SlRabE1a是否調(diào)控其他煙草花葉病毒屬病毒的侵染，研究者驗證了SlRabE1a與TMV、ToMV和ToMMV的MP之間的相互作用。Co-IP實驗顯示，SlRabE1a可以與TMV、ToMV和ToMMV的MP相互作用(圖4A)。BiFC實驗進一步證實了這些相互作用(圖4B)。在番茄植株中敲除SlRabE1a抑制了TMV、ToMV和ToMMV的系統(tǒng)侵染(圖4C和4D)。在本氏煙植株中沉默NbRabE1a.1也抑制了TMV、ToMV和ToMMV的細胞間運動(圖4E和4F)。這些結(jié)果表明RabE1a在煙草花葉病毒屬病毒的系統(tǒng)侵染和細胞間運動中至關(guān)重要。

圖4. RabE1a與另外三種煙草花葉病毒屬病毒MP相互作用，并參與了這三個病毒的細胞間運動。

5.ToBRFV MP細胞內(nèi)移動的推測的模型

總之，研究者提出了一個模型，其中MP劫持分泌途徑和內(nèi)吞途徑以參與ToBRFV的胞內(nèi)運動（圖5）。ToBRFV MP與RabE1a相互作用，并劫持由RabE1a和SEC10共同調(diào)控的分泌途徑到達質(zhì)膜。到達質(zhì)膜后，MP與AP2β相互作用，劫持內(nèi)吞途徑到達胞間連絲，然后以核糖核蛋白復(fù)合體的形式通過胞間連絲進入鄰近細胞。研究結(jié)果全面展示了MP的胞內(nèi)運輸過程，并為培育抗ToBRFV及相關(guān)煙草花葉病毒屬病毒的番茄種質(zhì)資源提供了新的靶點。

圖5. RabE1a和SEC10b介導(dǎo)的分泌途徑以及AP2β調(diào)控的內(nèi)吞途徑在ToBRFV胞內(nèi)運輸中的作用模型。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生馬華玉為第一作者，李向東教授和閆志勇博士為共同通訊作者，田延平教授、江軍教授、耿超副教授參與了研究工作。該研究受到國家自然科學(xué)基金以及山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程等項目的資助。

論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70138

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